使用Cell Ranger处理10x Genomics测序数据是一个多步骤的过程，涉及到数据的质量控制、读段的映射到参考基因组、识别和定量单细胞中的转录本。

  • 5’端（五端）：指一个核酸分子中磷酸基团连接的那一端。在DNA和RNA的线性表示中，5’端通常位于左侧。
  • 3’端（三端）：指一个核酸分子中羟基连接的那一端。在DNA和RNA的线性表示中，3’端通常位于右侧。

检查FASTQ文件

Cell Ranger进行测序的FASTQ文件通常遵循特定的命名约定:

sample_S1_L001_R1_001.fastq.gz
sample_S1_L001_R2_001.fastq.gz
sample_S1_L002_R1_001.fastq.gz
sample_S1_L002_R2_001.fastq.gz

命名规则
[Sample Name]_S1_L00[Lane Number] _[Read Type]_001.fastq.gz

这里，L001和L002表示流水线编号，R1和R2表示读段的方向。

  • I1: Sample index read (optional)
  • I2: Sample index read (optional)
  • R1: Read 1
  • R2: Read 2

运行Cell Ranger count

cellranger count --id=MyProject \
                 --transcriptome=/path/to/reference_genome \
                 --fastqs=/path/to/my/fastq_files \
                 --sample=sample

–id=MyProject：指定输出目录的名称，Cell Ranger会在当前目录下创建一个名为MyProject的文件夹，其中包含运行结果。
–transcriptome=/path/to/reference_genome：指向你的参考基因组的路径。这应该是使用cellranger mkref创建或下载的参考基因组的文件夹。
–fastqs=/path/to/my/fastq_files：包含你的FASTQ文件的目录路径。
–sample=sample：指定FASTQ文件名中共有的样本名前缀。在这个例子中，所有文件都以sample开头，因此使用sample作为参数。

对于多个样本的分析，可以使用cellranger multi命令，它允许在一个运行中处理多个样本，并可以进行多种类型的分析，如单细胞转录组学和单细胞ATAC-seq的联合分析。

Cell Ranger运行完成后，会生成一个包含多个文件和文件夹的输出目录。重要的输出包括：

  • web_summary.html：一个包含高级别质量控制指标的可视化报告，可以在浏览器中查看。
  • outs/filtered_feature_bc_matrix/：包含过滤后的基因表达矩阵，可用于后续的分析，如聚类、差异表达分析等。

例子

# 压缩
$ gzip /Sample/Sample1.fastq
$ gzip /Sample/Sample2.fastq

# 改名
$ mv Sample1.fastq.gz Sample1_S1_L001_R1_001.fastq.gz
$ mv Sample2.fastq.gz Sample2_S1_L001_R1_001.fastq.gz


# 运行 
nohup cellranger count --id=Sample_analysis --transcriptome=/home/data/GenomeLib/refdata-gex-mm10-2020-A --fastqs=/home/data/fastData/Sample --localcores=10 &
  • –id：指定输出文件存放目录（我这里的是样本名）
  • –localcores :线程数
  • –transcriptome ：参考基因组文件目录，里面含有构建好的index
  • –fastqs ：fastq文件所在路径
  • –sample：要和fastq文件的前缀中的sample保持一致，作为软件识别的标志

然后查看 nohup 文件看日志, 就开始验证运行了


Martian Runtime - v4.0.11
Serving UI at http://server:33767?auth=jWMOT6C3fxc34jtIjYJLr2zv_a7hjA7RxgLQU-Bbvvw

Running preflight checks (please wait)...
Checking sample info...
Checking FASTQ folder...
Checking reference...
Checking reference_path (/home/data/GenomeLib/refdata-gex-mm10-2020-A) on kjtjserver...
Checking optional arguments...

结果

CellRanger_Use_Cover

注意

  • 在使用--sample参数时，需要确保指定的样本名与FASTQ文件名中的样本名完全匹配。如果样本名指定错误，Cell Ranger将无法识别正确的文件。
  • Cell Ranger期望输入的FASTQ文件遵循特定的命名约定，如SampleName_S1_L001_R1_001.fastq.gz。这里SampleName应与--sample参数中指定的样本名相匹配，S1表示样本编号，L001表示流水线号，R1或R2表示读段方向，001是分割文件的编号。如果你的文件名不遵循这个约定，Cell Ranger将无法正确识别它们。
  • 使用--fastqs参数指定的目录应该直接包含FASTQ文件或FASTQ文件所在的子目录。如果指定的目录不正确，或者FASTQ文件不在该目录下，Cell Ranger将找不到这些文件。
  • 如果你的测序数据来自特定的测序通道，需要通过--lanes参数指定这些通道。如果指定错误，或者不需要此参数但却错误地使用了它，可能会导致Cell Ranger找不到匹配的FASTQ文件。
  • Cell Ranger在处理数据时预期至少有Read1和Read2。