cellranger count

cellranger count 是10x Genomics提供的Cell Ranger软件包中的一个核心命令，用于处理单细胞RNA序列（scRNA-seq）数据。该命令执行了一系列复杂的数据处理步骤，从原始测序数据（FASTQ文件）出发，最终生成细胞的基因表达矩阵以及其他相关的分析结果。这些步骤主要包括：

  • 质量控制：检查原始测序数据的质量，包括读取的质量分数和序列的内容，以确定数据是否适合进一步分析。
  • 条形码处理：识别和处理细胞和UMI（Unique Molecular Identifier，独特分子标识符）条形码。这包括纠正可能的错误读取以及识别和去除非细胞或背景条形码。
  • 基因组比对：将读取（reads）比对到参考基因组或转录组上。这一步骤是通过使用高效的比对工具（如STAR）完成的，以确定每个读取来源于基因组的哪个位置。
  • UMI计数：为每个基因在每个细胞中统计UMI数量。这个步骤涉及到识别重复的UMI（可能是由PCR扩增引起的）并将它们合并为单一事件，从而准确计算每个基因的表达水平。
  • 生成特征-条形码矩阵：基于UMI计数，为每个细胞（每个唯一的条形码）和每个基因生成一个矩阵，其中矩阵的每个元素代表该细胞中该基因的表达量。
  • 细胞检测：基于UMI计数和其他标准（如基因的丰富度）确定哪些条形码代表真实的细胞。这个步骤帮助区分真正的单细胞数据和可能的背景或噪声。
  • 质量控制报告生成：生成详细的质量控制报告，包括基因表达水平的分布、检测到的细胞数量、UMI分布等指标，帮助用户评估数据质量和实验效果。
  • 初步数据分析：进行一些基本的数据分析，如降维（t-SNE、UMAP）、聚类分析等，以便快速了解样本中细胞的异质性和潜在的细胞类型。

执行cellranger count后，会在指定的输出目录中生成多个文件和文件夹，这些文件包含了从原始FASTQ文件到基因表达矩阵的处理结果，以及质量控制报告。下面是一些主要的输出文件及其作用：

  • outs/目录：这是cellranger count执行完成后数据输出的主要目录，包含了多个子文件夹和文件，用于存储分析结果。
  • **filtered_feature_bc_matrix/**：该目录包含了过滤后的特征-条形码矩阵，即每个细胞的基因表达矩阵。这个矩阵仅包括被认为是有效细胞的那些条形码。通常包含以下文件：
    • matrix.mtx.gz：压缩的稀疏矩阵文件，记录了基因表达数据。
    • features.tsv.gz：包含矩阵中每一行对应的基因或特征的信息。
    • barcodes.tsv.gz：包含矩阵中每一列对应的细胞条形码的信息。
  • **raw_feature_bc_matrix/**：该目录包含了原始特征-条形码矩阵，即包括所有读取到的条形码，不论其是否被认定为来自有效细胞。其结构与filtered_feature_bc_matrix/相同。
  • metrics_summary.csv：一个包含关键质量控制指标的CSV文件，如检测到的细胞数量、平均唯一分子标识符（UMI）计数等。
  • web_summary.html：一个交互式的HTML报告，总结了实验的主要结果和质量控制指标，包括细胞检测数量、基因检测数量以及UMI计数的分布图。这个报告对于快速评估实验质量很有用。
  • cloupe.cloupe：为Cell Ranger的Loupe Browser准备的文件，这是一个可视化和分析单细胞RNA测序数据的工具。该文件使用户能够在Loupe Browser中查看和探索数据。
  • analysis/目录：包含了一些自动化的初步分析结果，例如t-SNE或UMAP降维、聚类分析等，这些分析有助于理解细胞间的异质性。
  • possorted_genome_bam.bam：包含了所有reads的比对结果的BAM文件，这些reads已经根据它们映射到的基因组位置进行排序。这个文件对于进一步的数据分析和验证非常重要。

分析流程

filtered_feature_bc_matrix/目录下的文件包含了过滤后的特征-条形码矩阵，是单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析中一个重要的数据集，反映了每个细胞中每个基因的表达量。这些文件通常用于后续的数据分析，包括细胞聚类、差异表达基因分析、细胞类型标注。

数据预处理

  • 归一化：对基因表达矩阵进行归一化，以消除测序深度等因素的影响。
  • 筛选基因：去除表达量过低的基因，因为这些基因的表达可能不稳定或不具代表性。
  • 计算细胞的质量控制指标：例如，每个细胞中检测到的基因数量、UMI计数等，以去除低质量的细胞。

分析

降维分析

  • PCA（主成分分析）：用于降低数据维度，提取数据的主要变异来源。
  • t-SNE或UMAP：进一步降维并可视化细胞之间的相似性，帮助识别细胞亚群。

b.聚类分析

使用降维后的数据进行聚类，例如使用k-means或基于图的聚类方法（如Louvain算法），以识别相似的细胞亚群。

c.差异表达基因分析

对不同聚类（假定代表不同的细胞类型或细胞状态）的细胞进行差异表达基因分析，以识别每个细胞群体的标志性基因。

d.细胞类型标注

根据差异表达基因的知识库（如已知的标志性基因）对细胞亚群进行标注，确定细胞的可能类型。

e.通路和功能分析

利用差异表达基因进行通路和功能富集分析，探索细胞在生物学过程中的作用。

可视化

  • 细胞分布图：使用t-SNE或UMAP结果绘制细胞的2D分布图，可按聚类结果或特定基因的表达进行着色。
  • 热图：展示不同细胞群体中重要基因的表达模式。
  • 小提琴图或箱线图：展示特定基因在不同细胞群体中的表达分布。

例子

# 安装并加载Seurat包
install.packages("Seurat")
library(Seurat)

# 从表达矩阵创建Seurat对象
data <- CreateSeuratObject(counts = your_expression_matrix)

# 数据过滤
data <- subset(data, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)

# 数据标准化
data <- NormalizeData(data)

# 查找高变基因
data <- FindVariableFeatures(data)

# 运行PCA进行降维
data <- RunPCA(data)

# 根据PCA结果运行t-SNE
data <- RunTSNE(data)

# 聚类分析
data <- FindClusters(data)

# 可视化t-SNE结果
DimPlot(data)

运行

$ Rscript demo.R