转录组测序(bulk RNA-Seq)上游数据处理（未完成）

背景

Bulk RNA-seq (RNA sequencing) 是一种广泛使用的技术，用于研究细胞或组织样本中的总 RNA 表达情况。它可以帮助科学家定量分析样本中不同基因的表达水平，并了解基因在不同条件下的差异性表达。Bulk RNA-seq 和single cell RNA-seq的最主要区别在于单细胞测序代表单个细胞（single cell），而bulk测序代表一群细胞（a population of cells）。

原理

在 bulk RNA-seq 中，RNA 是从一个混合细胞群体（例如组织、培养细胞）中提取的。这意味着测序得到的数据是该细胞群体中所有细胞的平均表达情况，而不是单个细胞的表达水平。这种方法的步骤通常包括以下几个环节：

RNA 提取：从样本中提取总 RNA，通常只保留 mRNA。
RNA 片段化：将提取的 RNA 片段化，以适应高通量测序平台。
反转录为 cDNA：将 RNA 通过逆转录酶转录为互补 DNA（cDNA），这是因为 DNA 更稳定，且适合大多数测序平台。
建库和测序：对 cDNA 进行加接头和扩增，制备成测序文库，使用高通量测序仪（例如 Illumina）进行测序。
数据分析：将测序得到的短片段（reads）与参考基因组比对，进行定量分析以确定基因表达水平。常见的分析软件包括 STAR、HISAT2 和 DESeq2。

处理Bulk RNA-seq数据的基本流程

1.原始数据获取

2.质量控制（QC）

3.清理和剪切接头序列
根据质量控制结果，可以使用Trim Galore!或Cutadapt等工具去除低质量读数和接头序列。通常还需要去除过短的序列和低质量碱基。

trim_galore --paired HRR839864_S1_L001_R1_001.fastq HRR839864_S1_L001_R2_001.fastq

4.比对（Alignment）

使用STAR或HISAT2等比对工具将处理后的FASTQ文件与参考基因组进行比对。生成的输出文件通常是一个BAM或SAM文件，它们是排序过的比对结果。

hisat2 -x reference_genome -1 HRR839864_S1_L001_R1_001_trimmed.fastq -2 HRR839864_S1_L001_R2_001_trimmed.fastq -S output.sam

5.生成表达量矩阵
通过使用工具如featureCounts或HTSeq对比对好的BAM文件进行计数，计算每个基因的read count，生成一个计数矩阵。每一行代表一个基因，每一列代表一个样本。

featureCounts -a reference.gtf -o counts.txt output_sorted.bam

annotations.gtf文件是参考基因组的注释文件，aligned_sample.bam是比对后的文件，gene_counts.txt是生成的表达量矩阵文件。

6.数据标准化

为了消除测序深度差异，通常需要对计数矩阵进行标准化。常用的标准化方法包括：

TPM（每百万转录本）：计算转录本的长度校正后的表达量。
FPKM（每千碱基的片段数）：用于比较相同样本中的不同基因。
RPKM（每千碱基的读数数）：类似于FPKM，但适用于单端测序数据。
- DESeq2 或 EdgeR的归一化：用于差异表达分析，归一化为每个样本的size factors。

下面是一个大体代码流程，我们现在有HRR839864_S1_L001_R1_001.fastq.gz和HRR839864_S1_L001_R2_001.fastq.gz这俩数据举例子:

# 质量控制
fastqc HRR839864_S1_L001_R1_001.fastq.gz HRR839864_S1_L001_R2_001.fastq.gz

# 剪切低质量数据
trim_galore --paired HRR839864_S1_L001_R1_001.fastq.gz HRR839864_S1_L001_R2_001.fastq.gz


(做到了再用实际案例添加)

优劣性

优

无偏性：与微阵列不同，RNA-seq 不依赖预定义探针，因此可以检测到新的、未知的转录本。
高分辨率：RNA-seq 可以提供单碱基分辨率的信息，能够检测到基因的不同转录本、剪接变体以及单核苷酸变异。
灵活性：适用于多种 RNA 类型的研究，如 mRNA、miRNA、circRNA 等。

劣

平均化效应：由于 bulk RNA-seq 是对细胞群体的平均表达水平进行测量，无法区分不同细胞类型间的差异。如果样本中存在异质性细胞类型，可能会掩盖重要的细胞特异性表达信息。
样本复杂性：需要处理大量的测序数据，数据分析过程复杂，对计算资源要求较高。

bajiu

转录组测序(bulk RNA-Seq)上游数据处理（未完成）

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处理Bulk RNA-seq数据的基本流程

优劣性

优

劣